Undertale đặt bối cảnh dưới lòng đất trong một ngọn núi tên Ebott. Trước kia có hai dòng tộc Con người và Quái vật, họ chung sống vui vẻ với nhau. Đến một ngày, con người nổ ra một cuộc chiến với dòng tộc kia, họ chiến thắng và giam cầm quái vật xuống lòng đất bằng một rào chắn được niêm phong. Bất cứ ai có thể vào nhưng không thể thoát ra. Một đứa trẻ (Frisk) đã rơi xuống lòng đất và gặp Flowey, một bông hoa có vai trò giới thiệu cho người chơi cách thức hoạt động của trò chơi, cho biết "LV" là "LOVE" và cách để thu nhận "EXP" là giết quái vật. Khi Flowey cố chiếm đoạt linh hồn của Frisk, cậu đã bị Toriel ngăn chặn - một quái vật có hình dạng giống dê. Toriel muốn Frisk giải quyết những câu đố và vượt qua lòng đất mà không giết bất kỳ ai. Toriel nhận đứa trẻ làm con nuôi của bà, để bảo vệ con người này khỏi Asgore Dreemurr, vị vua của lòng đất.

Đứa trẻ quyết ra khỏi nhà Toriel và đến lâu đài của Asgore, nơi có rào chắn nối lên mặt đất. Trên chuyến hành trình, người chơi gặp vô vàn quái vật, như hai anh em thuộc nhà xương Sans và Papyrus, hai người có nhiệm vụ canh gác lòng đất.Undyne là đội trưởng đội cận vệ hoàng gia. Alphys,một nhà khoa học làm việc cho hoàng gia và Mettaton, một con robot và là một ngôi sao truyền hình do Alphys tạo ra. Người chơi có hai lựa chọn là điều khiển Frisk giết hoặc tha khi gặp một quái vật, tha được ưu tiên, vì lựa chọn này khiến quái vật làm bạn với người chơi. Suốt hành trình, người chơi được hiểu thêm về cuộc chiến của con người và quái vật. Asriel, con của Asgore và Toriel cũng như vị hoàng tử của lòng đất, đã làm bạn với con người rơi xuống đầu tiên (Chara), và được gia đình hoàng gia nhận nuôi. Một ngày, đứa trẻ này dính độc bởi những bông hoa. Asriel lên mặt đất và đưa cơ thể con người này về làng, nhưng dân làng đã thấy và giết cậu. Vị vua Asgore không thể phá vỡ rào chắn kia, phải nhờ đến bảy linh hồn con người để làm việc đó, ông đã có sáu linh hồn trong tay, và còn một linh hồn cuối cùng là của Frisk.

Cách người chơi giải quyết những trận đấu với quái vật dẫn đến nhiều kết thúc (ending) khác nhau. Có ba kết thúc gồm Genocide Ending (Kết thúc Diệt chủng), Neutral Ending (Kết thúc Trung Lập) và Pacifist Ending (Kết thúc Hòa bình). Nếu người chơi giết các quái vật nhưng để một vài sống sót, đứa trẻ đi đến lâu đài của Asgore. Sans chặn đứa trẻ trước con đường cuối trò chơi, tại đây đứa trẻ biết được "LOVE" là một từ viết tắt của "level of violence" (cấp độ bạo lực) và "EXP" là viết tắt cho "execution points" (điểm kinh nghiệm). Sans phán xét đứa trẻ dựa trên cách mà đứa trẻ đã hành động trong mỗi trận đấu trước đó. Đứa trẻ chiến đấu Asgore, Flowey xuất hiện và giết ông ngay tức khắc, rồi hấp thụ tất cả sáu linh hồn. Cùng với sức mạnh từ các linh hồn, Flowey trở nên mạnh mẽ và nhanh chóng bị đánh bại. Đứa trẻ có lựa chọn giết hoặc không giết Flowey trước khi nhận một cuộc gọi từ Sans nói về số phận của lòng đất. Cùng với sự biến mất của sáu linh hồn, người chơi vẫn không thể rời khỏi lòng đất.